WWW.KNIGI.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

«2012 КОНФОРМАЦИОННОЕ РАВНОВЕСИЕ И РН-ЗАВИСИМОСТЬ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ КРАСНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА KFP А.С.Горященко1, А.Л.Русанов1, В.А.Миронов2, Б.Л.Григоренко2, ...»

-- [ Страница 1 ] --

ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ

ежегодной научной конференции

ИНСТИТУТА БИОХИМИИ

имени А.Н.Баха РАН

2012

КОНФОРМАЦИОННОЕ РАВНОВЕСИЕ И РН-ЗАВИСИМОСТЬ

ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ КРАСНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА KFP

А.С.Горященко1, А.Л.Русанов1, В.А.Миронов2, Б.Л.Григоренко2, А.В.Немухин2,

1

А.П.Савицкий

1

Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН 2 МГУ им. М.В.Ломоносова, Химический факультет Публикации 1. Rusanov, A.L., Mironov, V.A., Goryashenko, A.S., Grigorenko, B,L., Nemukhin, A.V., Savitsky, A.P., Conformational Partitioning in pH-Induced Fluorescence of the Kindling Fluorescent Protein (KFP).

J. Phys. Chem. B (2011), Vol. 115(29), pp. 9195-9201.

Резюме работы Флуоресцирующие белки широко применяются как генетически кодируемые флуоресцентные маркеры экспрессии генов и локализации белков в клетках, а также как биосенсоры. Особенностью хромопротеина KFP является существенное увеличение его флуоресценции при облучении зеленым светом. Однако, к росту флуоресценции могут привести и другие факторы, одним из которых является изменение рН. Целью данной работы было изучение влияния рН на флуоресцентные свойства KFP.

Изменение рН привело к сдвигу положения максимума поглощения, возбуждения и эмиссии флуоресценции KFP. Анализ рН-зависимости спектров поглощения и флуоресценции KFP позволил выдвинуть предположение, согласно которому рост флуоресценции при щелочных рН обусловлен смещением конформационного равновесия между различными формами белка в растворе. Основываясь на данных о кристаллической структуре KFP и результатах молекулярного моделирования, было предположено, что появление новых форм белка вызвано изменениями в структуре водородных связей в окружении хромофора, но не в нем самом. Согласно полученным результатам, наиболее существенными являются изменения структуры взаимодействий, связанных с боковыми цепями остатков Cys62 и Ser158. Таким образом, флуоресцентные свойства KFP зависят от конформационного состояния белка и его ионизации при щелочных рН.

FRET-FLIM ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ-КОДИРУЕМЫХ СЕНСОРОВ

НА ОСНОВЕ ЦВЕТНЫХ БЕЛКОВ

В.В.Жердева1, А.Л.Русанов1, Л.Р.Арсланбаева1, М.Г.Хренова2, А.В.Немухин2, Т.В.Городничева3, Т.В.Ивашина4, Л.М.Винокуров4, А.П.Савицкий Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН МГУ им. М.В.Ломоносова, Химический факультет ЗАO « Евроген», Москва Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН Публикации 1. Л.Р.Арсланбаева, В.В.Жердева, Т.В.Ивашина, Л.М.Винокуров, В.Б.Морозов, А.Н.Оленин, А.П.Савицкий. Индуктивно-резонансный перенос энергии между тербийсвязывающим пептидом и красными флуоресцентными белками DsRed2 и TagRFP. Биофизика, 2011, том 56, вып. 3, с. 389-395.

2. Alexander P. Savitsky, Alexander L. Rusanov, Victoria V. Zherdeva, Tatiana V. Gorodnicheva, Maria G. Khrenova and Alexander V. Nemukhin. FLIM-FRET Imaging of Caspase-3 Activity in Live Cells Using Pair of Red Fluorescent Proteins. Theranostic, 2012 (принята в печать).

Резюме работы Визуализация и количественная оценка белок-белкового взаимодействия в клетке являются актуальными задачами современного биоимиджинга. Флуоресцентная микроскопия, в основе которой лежит получение изображений с распределением времен жизни флуорофора, (FLIM) и метод флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) обеспечивают высокое пространственное (нанометры) и временное разрешение (наносекунды) сигнала, что позволяет улавливать молекулярные события.

В нашей работе была осуществлена регистрация протеолитической активности каспазыключевого фермента апоптоза, в живых клетках с использованием FRET-FLIM технологии и конфокальной микроскопии. Объектом исследований являлась клеточная трансдуцированная опухолевая линия A549, полученная путем лентивирусной трансфекции и экспрессирующая генетически-кодируемый субстрат каспазы-3 (TagRFP-23-KFP) на основе цветных флуоресцирующих белков TagRFP и KFP. Для расчета эффективности переноса энергии и анализа возможных стерических затруднений между субстратом TagRFP-23-KFP и димером каспазы-3 была проведено компьютерное моделирование. Имиджинг протеолитической активности каспазы-3 был получен как распределение усредненного времени жизни молекулы TagRFP (донора), которое изменялось от 1.8-2.1 нс для нерасщепленной конструкции до 2.4-2. нс для расщепленной каспазой-3 конструкции. Появление долгоживущей компоненты при расщеплении соответствовало времени жизни TagRFP в несвязанном состоянии. Анализ распределения времени жизни в клетках позволил дискриминировать апоптотические клетки от живых клеток в пределах одной клеточной популяции. Данный подход является высокоинформативным и не зависит от концентрации флуорофора и фоновой флуоресценции.

Поскольку, как это было показано нами ранее, мыши обладают фоновой флуоресценцией с временем жизни порядка 1.5 нс, для повышения чувствительности нами начаты работы по разработке генетически-кодируемых сенсоров на основе лантанидных хелатов и флуоресцентных цветных белков. В качестве донора во FRET-паре был использован тербий-связывающий пептид (Tb3+-СП), в котором триптофан являлся сенсибилизатором флуоресценции лантанидов, а в качестве акцептора был использован красный флуоресцентный белок DsRed2 или TagRFP. Были изучены условия FRET, рассчитаны значения эффективности FRET для двух пар Tb3+-СП-DsRed2 и Tb3+-СП-TagRFP. Уникальным свойством таких сенсоров является миллисекундная флуоресценция акцептора вследствие переноса энергии с лантанидов, что имеет важное преимущество перед другими сенсорами, проявляющееся в увеличении соотношения сигнал/фон за счет минимизации наносекундного фонового сигнала.



Разработанные сенсоры и выбранные подходы в регистрации флуоресцентного сигнала являются высокоинформативными инструментами для детекции молекулярных событий in vitro и in vivo, что предполагает их использование в высокоэффективном скрининге лекарственных соединений и молекулярном биоимиджинге.

ВЛИЯНИЕ 2-ГИДРОКСИПРОПИЛ-БЕТА-ЦИКЛОДЕКСТРИНА

НА АГРЕГАЦИЮ БЕЛКОВ

О.И.Малолеткина1, К.А.Маркосян1, С.Ю.Клейменов1, В.Ф.Макеева1, Н.А.Чеботарева1, Б.И.Курганов1, Л.В.Белоусова2, Р.А.Асриянц3, П.И.Семенюк3, В.Н.Орлов3, Н.Б.Полянский4, К.О.Муранов Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН МГУ им. М.В.Ломоносова, Биологический факультет Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им.

М.В.Ломоносова Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН Публикации 1. Maloletkina O.I., Markossian K.A., Belousova L.V., Kleimenov S.Y., Orlov V.N., Makeeva V.F., Kurganov B.I. (2010) Thermal stability and aggregation of creatine kinase from rabbit skeletal muscle.

Effect of 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin. Biophys. Chem., v. 148, p.121-130.

2. Maloletkina O.I., Markossian K.A., Asryants R.A., Semenyuk P.I., Makeeva V.F., Kurganov B.I.

(2010) Effect of 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin on thermal inactivation, denaturation and aggregation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from rabbit skeletal muscle. Int. J. Biol.

Macromol., v. 46, p. 487-492.

3. Maloletkina O.I., Markossian K.A., Chebotareva N.A., Asryants R.A., Kleymenov S.Y., Poliansky N.B., Muranov K.O., Makeeva V.F., Kurganov B.I. (2012) Kinetics of aggregation of UV-irradiated glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from rabbit skeletal muscle. Effect of agents possessing chaperone-like activity. Biophys. Chem., in press.

Резюме работы Изучено влияние 2-гидроксипропил-бета-циклодекстрина (ГПЦД) на тепловую денатурацию и агрегацию креатинкиназы (КК) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД) из скелетных мышц кролика. По данным дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) термостабильность КК не изменялась в присутствии ГПЦД. Влияние ГПЦД на тепловую агрегацию КК, исследованное методом динамического светорассеяния, было объяснено в рамках механизма, согласно которому начальной стадией процесса агрегации является образование стартовых агрегатов. Характеристикой скорости агрегации служит параметр t2R (интервал времени, за который происходит увеличение значения гидродинамического радиуса агрегатов белка в два раза). Чем выше значение 1/t2R, тем выше скорость агрегации. Подавление агрегации КК под действием ГПЦД происходило в результате увеличения длительности лаг-периода кинетических кривых агрегации и уменьшения значения 1/t2R. В присутствии 76 мМ ГПЦД наблюдалось 10-кратное снижение значения 1/t2R.

Гидродинамический радиус стартовых агрегатов возрастал от 30 нм в отсутствие ГПЦД до нм в присутствии 76 мМ ГПЦД.

Форма ДСК профилей ГАФД, полученных в присутствии ГПЦД, показывает, что ГПЦД снижает тепловую стабильность ГАФД. Именно снижение стабильности ГАФД является причиной усиления тепловой агрегации ГАФД в присутствии ГПЦД. Начальные участки зависимостей гидродинамического радиуса (Rh) белковых агрегатов от времени линейны.

Увеличение скорости агрегации ГАФД в присутствии ГПЦД вызвано уменьшением длительности лаг-периода кинетических кривых агрегации и увеличением скорости изменения значений Rh во времени. Таким образом, главным фактором, определяющим характер влияния ГПЦД на тепловую агрегацию ГАФД, является уменьшение термостабильности ГАФД в присутствии ГПЦД.

Разработана новая тест-система для скрининга антиагрегационных агентов, основанная на агрегации УФ-облученной ГАФД. Показано, что в результате УФ-облучения в растворе присутствуют развернутые молекулы белка, что дает возможность исследовать влияние различных агентов, обладающих шапероноподобной активностью, непосредственно на стадию агрегации белка в условиях, близких к физиологическим (37 С). С помощью данной тестсистемы показан защитный эффект ГПЦД на агрегацию ГАФД.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МАЛЫХ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА

С БЕЛКОВЫМ СУБСТРАТОМ В УСЛОВИЯХ КРАУДИНГА

Н.А.Чеботарева1, С.Г.Роман1, Т.Б.Еронина1, В.Ф.Макеева1, С.Ю.Клейменов1, К.О.Муранов2, Н.Б.Полянский2, Н.Б.Гусев3, Б.И.Курганов Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

ИБХФ РАН

МГУ им. М.В.Ломоносова, Биологический факультет, кафедра биохимии Публикации 1. Roman S.G., Chebotareva N.A., Eronina T.B., Kleymenov S.Yu., Makeeva V.F., Poliansky N.B., Muranov K.O., Kurganov B.I. Does crowded cell-like environment reduce the chaperone-like activity of -crystallin? Biochemistry, 2011, 50, 10607- 2. Chebotareva N.A., Makeeva V.F., Bazhina S.G., Eronina T.B., Gusev N.B., Kurganov B.I. Interaction of Hsp27 with native phosphorylase kinase under crowding conditions. Macromolecular Bioscience, 2010, 10(7):783- Резюме работы Главной функцией малых белков теплового шока (sHsp), одного из классов молекулярных шаперонов, является предотвращение агрегации денатурированных белков. В основе шапероно-подобной активности sHsp лежит их взаимодействие с развернутыми формами белков-субстратов, образующихся в условиях стресса (например, при тепловом или УФ-индуцированном стрессе). Ожидается, что в клетке краудинг усиливает белок-белковые взаимодействия, в том числе и агрегацию белков. Влияние краудинга на шапероно-подобную активность -кристаллина, представителя семейства sHsp, было изучено на тест-системе, основанной на агрегации УФ-облученной гликогенфосфорилазе b (Phb). Эта тест-система позволяет исследовать влияние разных агентов непосредственно на стадию агрегации белка.



Pages:     || 2 | 3 | 4 |