WWW.KNIGI.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 16 |

«Учебно-методическое обеспечение для подготовки магистров по программам высшего профессионального образования направления подготовки Нанотехнология с профилем подготовки ...»

-- [ Страница 5 ] --

Форма и положение максимума спектра испускания флуоресценции также не зависят от длины волны возбуждения флуоресценции. Максимум спектра испускания флуоресценции всегда лежит в более длинноволновой области, чем максимум самой длинноволновой полосы поглощения молекулы (рисунок 15, Б). Разность между положениями максимумов спектра флуоресценции и длинноволновой полосы поглощения называют стоксовым сдвигом.

Величина стоксова сдвига для разных флуорофоров варьирует от нескольких до 100 и более нанометров.

Следует помнить, что когда микроокружение флуорофора меняется, или он образует комплексы с другими молекулами, то может происходить изменение квантового выхода флуоресценции, а также формы и положения максимума спектра испускания флуоресценции.

Примерами биологических молекул, не обладающих флуоресценцией, являются сахара, ДНК, РНК (за очень редким исключением).

Примерами биологических молекул, обладающих флуоресценцией, являются ароматические аминокислоты и белки их содержащие, хлорофилл и многие другие пигменты растений.

Эффект флуоресценции широко применяется в исследовательской практике. Приборы на основе эффекта флуоресценции включают в себя:

спектрофлуориметры и планшетные флуориметры, которые используются для измерений в растворах, взвесях и суспензиях;

флуоресцентные микроскопы, которые используются для измерения пространственного распределения флуоресценции в объектах размером от нескольких миллиметров до нескольких микрон;

флуоресцентные сканеры, гель-документирующие устройства со столиками осветителями, которые используются для измерения пространственного распределение флуоресценции в макро-объектах (электрофорезные гели, блоты и хроматограммы) размером от 1-2 до 15-20 см.

проточные цитометры, которые используются для измерения флуоресценции от клетки, как целого, при прохождении суспензии клеток через проточный капилляр.

приборы для капиллярного электрофореза, ВЭЖХ, сиквенаторы, с детекцией на основе флуоресценции.

В оптической микроскопии применяется большое количество методик основанных на явлении флуоресценции. Эти методики могут использовать следующие параметры:

интенсивность флуоресценции, которая позволяет характеризовать наличие и относительную концентрацию флуорофора;

форма спектра и положение максимума, которые обеспечивают идентификацию флуорофора, анализ его микроокружения и взаимодействий;

время жизни флуоресценции, которое обеспечивает идентификацию флуорофора, анализ его микроокружения и взаимодействий.

Рассмотрим устройство флуоресцентного микроскопа. В основе его – конструкция, разработанная для наблюдения объектов в отраженном свете (рисунок 10). Дополнительно в составе флуоресцентного микроскопа обязательно присутствует стандартная система освещения объекта по методу проходящего света (рисунок 16). Основным отличием является замена полупрозрачного зеркала, на два светофильтра и дихроичное зеркало, которые объединены в специальный блок – кубик (рисунки 16, 17 А). Первый светофильтр (фильтр возбуждения) пропускает от источника-осветителя излучение в выбранном диапазоне длин волн, необходимом для возбуждения люминесценции в исследуемом объекте. Этот светофильтр может быть полосовым (пропускает свет в пределах заданного диапазона длин волн) или барьерным (пропускает свет с длиной волны короче заданной). Дихроичное зеркало эффективно отражает свет, пропускаемый фильтром возбуждения, но прозрачно в более длинноволновом диапазоне для флуоресценции, испускаемой образцом. Чаще всего дихроичное зеркало является барьерным фильтром, т.е. отражает свет короче некоторой длины волны и пропускает более длинноволновое излучение. Второй светофильтр (фильтр детекции) пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только флуоресценцию. Этот светофильтр может быть или полосовым (узко- или широко-полосным), или барьерным. На рисунке 17 Б представлены примеры спектров барьерных фильтров и дихроичного зеркала, формирующих кубик для регистрации флуоресценции в красной области спектра.

Во флуоресцентном микроскопе препарат освещается через объектив, который выполняет роль конденсора. Испускаемая препаратом флуоресценция собирается тем же объективом и после прохождения через систему фильтров (флуоресцентный кубик) отправляется на окуляры или на цифровую фотокамеру. Таким образом, разрешающая способность флуоресцентного микроскопа определяется только числовой апертурой объектива согласно формуле (6). Яркость изображения флуоресцирующего препарата определяется формулой (10).

ОСНОВЫ ОПТИЧЕСКОЙ МИКРОСКОПИИ

Рисунок 16. Принципиальная оптическая схема прямого Флуоресцентный микроскоп является замечательным инструментом для исследования тонких (от десятых микрона до 5-8 микрон) флуоресцирующих препаратов, окрашенных одним или несколькими флуорофорами. Как и обычный световой микроскоп, флуоресцентный микроскоп обеспечивает субмикронное разрешение в плоскости препарата.

Свет, проходя через образец, возбуждает флуоресценцию не только в исследуемом слое, но и во всех слоях выше и ниже исследуемого. Поэтому в толстых препаратах (толщиной более 10 мкм) на изображение флуоресцирующих структур в исследуемом оптическом сечении накладывается размытая (нерезкая) флуоресценция, излучаемая соседними слоями образца, что может существенно ухудшать качество изображения.

А. Общий вид флуоресцентного «кубика».

Б. Пример пропускания (Т) и отражения (R) фильтров и дихроичного зеркала, используемых во флуоресцентном «кубике».



2.2. Собственные клеточные флуорофоры. Флуоресцирующие биологически-активные соединения Флуорофоры и их характеристики, существенные для микроскопии. Для того, чтобы применять флуоресцентную микроскопию, необходимо, чтобы в составе исследуемых объектов присутствовали флуорофоры. Флуорофоры могут естественным образом входить в состав объекта, или их можно ввести туда искусственно, чтобы окрасить (контрастировать) те или иные структуры. Какие характеристики флуорофоров важны для флуоресцентной микроскопии?

Поглощение флуорофора. В большинстве микроскопов источники света и оптические элементы позволяют возбуждать флуоресценцию светом в диапазоне 340-650 нм. Следовательно, флуорофоры должны иметь электронные переходы (полосы поглощения) в этом диапазоне. Чем больше коэффициент молярной экстинкции флуорофора (молярное поглощение), тем меньшая интенсивность света требуется для его избирательного возбуждения и наблюдения в присутствии других флуорофоров. Для микроскопии удобны флуорофоры с коэффициентом молярной экстинкцией не менее 30000-40000 М-1см- в области длин волн возбуждения. Рекордсменами являются флуорофоры, у которых коэффициент молярной экстинкции достигает 150000 М-1см-1.

ОСНОВЫ ОПТИЧЕСКОЙ МИКРОСКОПИИ

Следует учитывать следующие особенности:

- в УФ области (340-400 нм) пропускание света оптикой сравнительно низкое и следует использовать объективы, оптимизированные для исследований в УФ диапазоне; высок риск повреждения биологических структур УФ светом; если флуоресценция введенных в образец (экзогенных) флуорофоров при возбуждении в области 340-400 нм слабая, то необходимо учитывать возможный вклад собственной флуоресценции компонентов образца (пиридиннуклеотидов в случае клеток эукариот);

- флуорофоры, поглощающие в области 620-650 нм, флуоресцируют в диапазоне длин волн длиннее 670 нм, где чувствительность глаза снижается и необходимо использовать системы детекции, с высокой чувствительностью в красной области (ПЗС-матрицы цифровых фотоаппаратов и видеокамер идеально подходят для этого).

Флуоресценция флуорофора. Высокий квантовый выход флуоресценции является важной характеристикой флуорофора. Чем больше этот параметр, тем легче регистрировать флуоресценцию при низких концентрациях флуорофора, и тем меньшая интенсивность света требуется для его избирательного возбуждения и наблюдения в присутствии других флуоресцирующих молекул. Удобно, если ширина спектра флуоресценции (ширина спектра на полувысоте) флуорофоров небольшая (меньше 40 нм). Тогда, используя полосовые фильтры детекции, подобранные под флуоресценцию каждого флуорофора, можно избирательно наблюдать и сравнивать структуры, окрашенные разными флуорофорами, в пределах одного и того же образца. Широкие спектры флуоресценции могут приводить к перекрыванию спектров различных флуорофоров, присутствующих в многокомпонентном образце. В этом случае намного сложнее подобрать условия для избирательной регистрации свечения отдельных типов флуорофоров. В общем случае задачу избирательной регистрации флуоресценции заданных флуорофоров в составе многокомпонентного образца решают подбором комбинации фильтров возбуждения (обеспечивает более избирательно возбуждение нужного флуорофора) и фильтров детекции (обеспечивает более избирательную регистрацию флуоресценции нужного флуорофора).

Чем выше фотостабильность флуорофора, тем удобнее его применять во флуоресцентной микроскопии. Количественной мерой фотостабильности является число квантов света, которое флуорофор может поглотить (число циклов возбуждения молекулы и релаксации в основное состояние) прежде, чем произойдет его необратимое разрушение (иными словами, фотообесцвечивание, фотодеградация, фотоокисление). При фотообесцвечивании разрушается исходная электронная структура хромофора и исчезает (в некоторых случаях меняется) его способность флуоресцировать. Фотообесцвечивание наблюдается в микроскопе, как ослабление и часто полное исчезновение флуоресценции исследуемого образца в процессе наблюдения. Это ослабление флуоресценции происходит в области, которая находится в поле зрения объектива и, следовательно, непрерывно возбуждается светом. Выключение света на какой-то период не приводит к восстановлению флуоресценции (необратимая фотодеградация). Смещение в новую область приводит к «появлению» флуоресценции образца, которая быстро начинает ослабевать из-за процессов фотообесцвечивания. Для уменьшения фотообесцвечивания следует снижать интенсивность возбуждающего света и подавать световой поток на образец только на короткое время, необходимое для регистрации изображения.

Кроме специальных случаев, важно, чтобы флуорофор обладал пониженной чувствительностью к факторам, вызывающим тушение (или усиление) флуоресценции (снижение/увеличение квантового выхода фуоресценции).

Флуоресценцию часто используют для выявления распределения и относительной концентрации флуорофоров в образце. Если флуоресценция в некоторых областях образца тушится (усиливается) какими-либо факторами, то наблюдаемое свечение уже не может характеризовать распределение и относительную концентрацию флуорофора в образце.

Особый интерес представляют флуорофоры, спектр флуоресценции которых значительно и специфически меняется под воздействием различных биологических факторов (рН, ионы, ферментная активность, гидрофобность/ полярность микроокружения) и при сближении с определенными молекулярным группировкам- тушителями флуоресценции. На основе таких флуорофоров создают молекулярные инструменты для изучения физиологических процессов в живых биологических объектах, в частности, в клетках.

Еще один типов флуорофоров, представляющий отдельный интерес для флуоресцентной микроскопии, это пары флуорофоров, которые могут выступать в качестве донора и акцептора при флуоресцентном резонансном переносе энергии. Такие пары находят широкое применение в изучении межмолекулярных взаимодействий в составе сложных многокомпонентных объектов, в том числе и живых.



Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 16 |