WWW.KNIGI.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 16 |

«Учебно-методическое обеспечение для подготовки магистров по программам высшего профессионального образования направления подготовки Нанотехнология с профилем подготовки ...»

-- [ Страница 4 ] --

Благодаря дифракции света этот метод позволяет обнаруживать присутствие в растворах (газах) чрезвычайно мелких частиц. Изображения этих частиц выглядят, как набор дифракционных пятен, размер которых зависит не от формы и размеров частиц, а от характеристик микроскопа (числовой апертуры объектива и увеличения микроскопа). Ультрамикроскопия позволяет оценивать концентрацию частиц в растворе (или газовой фазе) и их средний размер. Метод применяется в коллоидной химии для наблюдения и анализа взвесей частиц в жидкой или газовой фазе. Возможность регистрации зависит от разности показателей преломления частицы и окружающей среды.

Если разность велика, как в случае взвеси металлических частиц в воде, то удается регистрировать присутствие частиц размером несколько нанометров.

Если разность показателей преломления мала, то предел регистрации – это частицы размерами более 20-30 нм.

ОСНОВЫ ОПТИЧЕСКОЙ МИКРОСКОПИИ

Метод фазового контраста основан на том, что световые волны, прошедшие через слабоконтрастный неокрашенный объект (фазовый объект) можно условно поделить на два типа. Первый тип – это световые волны, которые прошли через объект, не взаимодействуя с ним (S-волны). У этих волн не изменилась ни амплитуда, ни фаза, и они доминируют по интенсивности в случае прозрачных фазовых объектов. Второй тип – это световые волны, которые провзаимодействовали с неоднородностями объекта, отличающимися от окружения по показателю преломления (D-волны). D-волны изменили свою фазу, а также, если размеры неоднородностей сравнимы или меньше длины волны, то претерпели рассеяние и (или) дифракцию (отклонение от первоначального пути распространения). Суммарная интенсивность D-волн мала по сравнению с интенсивностью S-волн. Встречаясь в плоскости изображения S- и D-волны начинают интерферировать. В зависимости от разности фаз интерференция будет либо усиливать амплитуду результирующей волны, либо ее ослаблять. То есть разность фаз световых волн будет преобразована в разность амплитуд, которую уже может распознавать глаз. Однако в плоскости изображения доминируют S-волны, конструктивная интерференция которых между собой является доминирующим событием и формирует яркое светлое поле, на котором результат интерференции S- и D-волн практически незаметен. Задача фазовой микроскопии состоит, во-первых, в том, чтобы ослабить интенсивность доминирующих S-волн до уровня интенсивности D-волн. Тогда интерференция S- и D-волн будет основным источником для формирования изображения.

Во-вторых, для увеличения контрастности изображения необходимо, чтобы разность фаз интерферирующих S- и D-волн была близка либо к 0, либо к. Если разность фаз интерферирующих волн близка к 0, то эти волны дадут в изображении яркую точку (наибольшее усиление амплитуды света, конструктивная интерференция). Если разность фаз близка к, то эти волны дадут в изображении черную точку (максимальное ослабление амплитуды света, деструктивная интерференция). В результирующем изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит распределение фазовых неоднородностей, т.е. структур, отличающихся от локального окружения по показателю преломления света. Такое изображение называется фазовоконтрастным. Как же реализуются в микроскопе условия, необходимые для формирования фазово-контрастного изображения?

В плоскости фронтальной апертуры конденсора вместо апертурной диафрагмы помещают непрозрачную пластину с кольцевым вырезом, так что образец освещается кольцевым пучком света. В отсутствии препарата свет, собранный объективом фокусируется в задней фокальной плоскости объектива в виде яркого кольца. В присутствии фазового объекта это яркое кольцо будут формировать в основном S-волны, а дифрагированные и рассеянные D-волны будут пересекать фокальную плоскость объектива вне зоны яркого кольца S-волн. За счет пространственного разделения S- и D-волн в зоне задней фокальной плоскости объектива, возникает возможность избирательно воздействовать на интенсивность и фазу S- и D-волн. Для этого в этой плоскости помещается так называемая фазовая пластина с кольцевой канавкой или кольцевым выступом. Эту канавку (выступ) называют фазовым кольцом. Положение и ширина фазового кольца (канавки/выступа) точно совпадают с ярким кольцом света, формируемым S-волнами. На кольцевую канавку (выступ) наносят ослабляющее свет покрытие (например, напыляют тонкую полупрозрачную пленку металла). Оптическая плотность этого покрытия такова, что оно пропускает сквозь себя лишь 25-30% интенсивности света (S-волн). Тем самым достигается выравнивание S- и D-волн по интенсивности. Кроме того, волны, проходящие через фазовое кольцо (канавку/ выступ), набирают дополнительную разность фаз по сравнению с волнами, идущими через пластину вне области канавки (выступа). Глубину кольцевой канавки или высоту кольцевого выступа рассчитывают так, чтобы суммарная разность фаз S-волн, прошедших через канавку (выступ), и D-волн, идущих вне этой области, приблизилась к (в случае канавки), либо к 0 (в случае выступа). Тем самым решается задача усиления контраста изображения, возникающего при интерференции S- и D-волн. В современных микроскопах фазовое кольцо формируют прямо на поверхности одной из линз объектива, вытравливая на ней и зачерняя кольцевую канавку. Объективы для фазовоконтрастной микроскопии имеют специальную маркировку, и их не следует применять в методе светлого поля в проходящем или отраженном свете, если требуется получить высококачественное изображение амплитудного объекта с высоким разрешением.



ОСНОВЫ ОПТИЧЕСКОЙ МИКРОСКОПИИ

Рисунок 13 Принцип метода фазового контраста. Свет на пути от осветителя к конденсору проходит через кольцевую диафрагму, так что образец освещается кольцевым пучком света. В отсутствии препарата (схема слева) свет, собранный объективом (S-волны), фокусируется на фазовой пластинке в пределах фазового кольца (кольцевой выступ на фазовой пластинке). На кольцевой выступ нанесено ослабляющее свет (S-волны) покрытие. В присутствии фазового препарата (схема справа) свет частично дифрагирует и рассеивается на неоднородностях (структурах) с отличающимся от окружения показателем преломления. В результате этого у дифрагированных волн (D-волны) накапливается разность фаз по сравнению с S-волнами, прошедшими через препарат без взаимодействия с неоднородностями. Дифрагированные и рассеянные D-волны проходят через фазовую пластинку вне обФеофанов А.В.

ласти фазового кольца. Световые волны, идущие через фазовое кольцо (это преимущественно S-волны), приобретают дополнительную разность фаз по сравнению с волнами (D-волны), идущими через пластину вне области кольцевого выступа. В плоскости изображения S- и D-волны начинают интерферировать, усиливая или ослабляя амплитуду результирующей волны. В результате интерференции формируется изображение, распределение яркости (амплитуд) в котором воспроизводит распределение фазовых неоднородностей препарата, т.е. структур, отличающихся от локального окружения по показателю преломления света.

Рисунок 14. Фазово-контрастное изображение клеток.

Обратите внимание на яркие зоны вблизи границ клеток. Эти зоны типичный результат конструктивной интерференции S- и D-волн.

ОСНОВЫ ОПТИЧЕСКОЙ МИКРОСКОПИИ

РАЗДЕЛ 2. ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ

2.1. Эффект флуоресценции и устройство микроскопа на основе этого эффекта Флуоресценция и фосфоресценция относятся к явлениям испускания кванта света при релаксации молекулы из возбужденного электронного состояния в основное электронное состояние и имеют обобщенное название – люминесценция.

Фосфоресценция – это явление испускания кванта света при релаксации молекулы из возбужденного электронного состояния в основное электронное состояние, которое отличается от возбужденного мультиплетностью.

Как правило, фосфоресценция наблюдается при переходе из возбужденного триплетного в основное синглетное состояние. Вероятность таких переходов мала, в результате чего время жизни фосфоресценции (т.е. среднее время нахождения молекулы в возбужденном триплетном состоянии, которое завершается переходом в основное синглетное состояние с испусканием кванта света) составляет от миллисекунд до секунд.

Флуоресценция – это явление испускания кванта света при релаксации молекулы из возбужденного в основное электронное состояние одинаковой мультиплетности. Флуоресценция наблюдается при переходе из нижнего возбужденного синглетного в основное синглетное состояние (рисунок 15).

Вероятность таких переходов достаточно велика, в результате чего время жизни флуоресценции (т.е. среднее время нахождения молекулы в нижнем возбужденном синглетном состоянии, которое завершается переходом в основное синглетное состояние с испусканием кванта света) составляет около 1 - 10 нс. Далее мы будем рассматривать только явление флуоресценции, т.к. именно оно наиболее широко используется в оптической микроскопии.

Упрощенная диаграмма Яблонского, поясняющая эффект флуоресценции, показана на рисунке 15. После перехода в любое возбужденное электронное состояние (S1, S2 и т.д.) электронная система молекулы в результате внутренней конверсии релаксирует (характерные времена - пикосекунды) в нижнее возбужденное состояние S1. Из этого состояния молекула может перейти в основное состояние S0 безизлучательно или с испусканием кванта света. Молекулы, у которых доминирует безизлучательная релаксация, не флуоресцируют. Переход молекулы в возбужденное электронное состояние может быть вызван поглощением кванта света. Вероятность поглощения квантов света молекулой резко возрастает, когда энергия квантов (длина волны) света приближается к энергии одного из электронных переходов молекулы. Характерное время, за которое происходит поглощение кванта света и переход молекулы в возбужденное состояние, лежит в диапазоне фемтосекунд.

Зависимость интенсивности поглощения света молекулой от длины волны света называется спектром поглощения (рисунок 15, Б). Полосы в спектре поглощения соответствуют энергиям электронных переходов из основного состояния молекулы. Молекулу в целом или ее часть, способную поглощать свет, называют хромофором. Хромофор, обладающий способностью флуоресцировать, называют флуорофором.

Рисунок 15. A. Упрощенная диаграмма Яблонского, поясняющая эффект флуоресценции. S0- основной синглетный уровень. S1, S2- первый и второй возбужденные синглетные уровни. hвозб и hфл - кванты возбуждающего света и флуоресценции. Волнистые линиипути безизлучательной релаксации энергии.

Б. Примеры спектров поглощения (пунктирная линия) и флуоресценции (сплошная линия) молекулы. Спектр испускания флуоресценции лежит в более длинноволновом диапазоне, чем самая длинноволновая Чем больше квантов света поглотил флуорофор, тем больше квантов флуоресценции он испустит. Следовательно, когда длина волны (энергия) возбуждающего света приближается к длине волны (энергии) электронного перехода, происходит усиление, как интенсивности поглощения света, так и интенсивности испускания света (флуоресценции). А зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны возбуждающего света называется спектром возбуждения флуоресценции. В свою очередь, флуоресценция также характеризуется спектром, т.е. зависимостью интенсивности испускания света от длины волны. Этот спектр называется спектром испускания флуоресценции (рисунок 15, Б).

ОСНОВЫ ОПТИЧЕСКОЙ МИКРОСКОПИИ

При неизменных параметрах микроокружения отношение числа квантов испущенных молекулой к числу квантов ею поглощенных есть величина постоянная, и называется она квантовым выходом флуоресценции. По определению, величина квантового выхода не зависит от длины волны возбуждения флуоресценции и всегда меньше 1,0.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 16 |