WWW.KNIGI.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 16 |

«Учебно-методическое обеспечение для подготовки магистров по программам высшего профессионального образования направления подготовки Нанотехнология с профилем подготовки ...»

-- [ Страница 3 ] --

При наблюдении препаратов, которые освещаются с помощью конденсора, разрешающая способность микроскопа в равной степени зависит, как от свойств объектива, так и конденсора (формулы (8) и (9)). Конденсор - это, как и объектив, сложная система линз, которая характеризуется числовой апертурой, степенью коррекции хроматических аберраций и кривизны поля.

К важным характеристикам также относятся рабочее расстояние и тип конденсора. Числовая апертура конденсоров варьирует очень широко: от 0, до 1,4. Простой конденсор (типа широко используемого Аббе-конденсора) состоит из двух линз и для него характерны как хроматические аберрации, так и кривизна поля. При числовой апертуре конденсора меньше 0,4-0,5 эти искажения не слишком критичны для качества изображения. При увеличении числовой апертуры конденсора больше 0,5 для получения качественного изображения требуется вводить коррекцию на хроматические аберрации и кривизну поля. Эти требования учтены в апланарных-ахроматических конденсорах. В более простых апланарных конденсорах введена коррекция только на кривизну поля. Конденсоры с числовой апертурой до 0, являются суховоздушными, а для достижения числовой апертуры больше 1,0 конденсоры делают иммерсионного типа. В идеальном случае числовая апертура конденсора должна быть равна числовой апертуре объектива.

Однако на практике иммерсионные объективы с высокой числовой апертурой редко используют совместно с иммерсионными конденсорами равной числовой апертуры, ограничиваясь суховоздушным конденсором высокого качества.

Чем больше числовая апертура, тем меньше рабочее расстояние конденсора. Рабочее расстояние конденсора является фактором, который следует учитывать, если это конденсор для инвертированного микроскопа (смотри ниже), и этот микроскоп предполагается использовать для одной из следующих задач: исследования в планшетах, чашках Петри и флаконах; микрохирургические операции под микроскопом; исследования с применением микроинъекторов; электрофизиологические исследования. Во всех этих случаях рабочее расстояние должно быть достаточно большим, чтобы разместить на предметном столике под конденсором необходимое для экспериментов оборудование. Например, при А=0,35 рабочее расстояние конденсора составляет 70 мм, при А=0,55 рабочее расстояние - 26 мм, а при А=0,8 рабочее расстояние уменьшается до 7 мм (рисунок 8).

ОСНОВЫ ОПТИЧЕСКОЙ МИКРОСКОПИИ

Рисунок 8. Конденсоры для инвертированных микроскопов фирмы Zeiss (Германия), которые отличаются по числовой апертуре и рабочему расстоянию. Слева направо: числовая апертура увеличивается, Конденсоры отличаются по типу в зависимости от метода наблюдения объекта: светлопольные, темнопольные, фазово-контрастные, для интерференционного контраста. Все типы конденсоров используются для наблюдения объектов в проходящем свете (свет проходит сквозь образец и собирается объективом). Светлопольные конденсоры используются для наблюдения объектов по методу светлого поля и, как правило, имеют апертурную ирисовую (регулируемую по диаметру) диафрагму. Регулировочные винты позволяют либо центрировать эту диафрагму относительно оптической оси объектива (классический режим светлого поля), либо сместить диафрагму в сторону и реализовать режим косого освещения препарата. В некоторых случаях косое освещение позволяет усилить контраст и сделать изображение более «рельефным» за счёт образования теней. Фазово-контрастные конденсоры снабжены специальными кольцевыми диафрагмами. Конденсоры для интерференционного контраста оборудованы специальным оптическим элементом, необходимым для наблюдения объектов по методу интерференционного контраста. Темнопольные конденсоры- это довольно сложные специализированные оптические системы, обеспечивающие освещение образца по методу темного поля. Конденсоры могут быть узкоспециализированными (например, светлопольный или темнопольный конденсор) или универсальными. В универсальных конденсорах различные оптические элементы размещены в револьверном держателе и сменяют друг друга при повороте этого револьвера. Как результат, в одной конструкции удается совместить светлопольный, фазово-контрастный и интерференционного контраста конденсоры.

Классификация микроскопов.

Оптические микроскопы делятся:

– по областям применения на биологические, технические, хирургические;

– по классу сложности на учебные, рабочие, лабораторные и исследовательские;

– по виду микроскопии на проходящего и отраженного света, поляризационные, люминесцентные, темного поля, фазового контраста, дифференциального интерференционного контраста, полного внутреннего отражения, лазерные конфокальные, многофотонные, 4 (4Pi), инфракрасные, комбинационного рассеяния;

– по направленности светового потока на прямые и инвертированные.

Оптическая схема и общий вид прямого микроскопа показаны на рисунке 2. У прямого микроскопа объектив располагается над объектом (над предметным столиком), а конденсор – под объектом (под предметным столиком).

Оптическая схема и общий вид инвертированного микроскопа показаны на рисунке 9. У инвертированного микроскопа объектив располагается под объектом (под предметным столиком), а конденсор – над объектом (над предметным столиком).

Рисунок 9. Общий вид инвертированного микроскопа.

Принципиальная оптическая схема инвертированного микроскопа.

Инвертированный микроскоп удобен и широко используется, когда необходимо проводить наблюдения в планшетах, чашках Петри и т.п. или треОСНОВЫ ОПТИЧЕСКОЙ МИКРОСКОПИИ буется обеспечить доступ к образцу для манипуляций с ним (например, для микроинъекций, микроопераций на биологическом материале, смены среды, электрофизиологических измерений). В этом случае инвертированный микроскоп комплектуют конденсором с большим рабочим расстоянием (небольшой числовой апертуры). В результате между конденсором и предметным столиком остается пространство достаточное для размещения дополнительного оборудования или объемной биологической посуды (флаконы, планшеты и т.п.) с образцами (рисунки 8, 9). Следует учитывать, что качество изображений (разрешение, яркость), получаемых в проходящем свете с помощью инвертированного микроскопа снижается по мере уменьшения числовой апертуры конденсора (формулы (8) и (9)).



Изображение в микроскопе строится на основе света, провзаимодействовавшего с наблюдаемым объектом. Свет, взаимодействуя с веществом исследуемого объекта, может отражаться, преломляться и поглощаться. Во всех этих случаях уменьшается интенсивность прошедшего через образец и собранного объективом света, или иными словами уменьшается амплитуда света. Разные участки образца отличаются по способности отражать и рассеивать свет, имеют разные показатели преломления и коэффициенты поглощения и в результирующем изображении распознаются наблюдателем по яркости и цвету. Объекты эффективно меняющие амплитуду света называют амплитудными. Если амплитудные объекты достаточно прозрачны для света, то их освещают с помощью конденсора, а наблюдают через объектив, т.е.

исследуют в проходящем свете. Если убрать образец, то вместо изображения будет видно светлое однородно освещенное поле. Поэтому другое название данного метода наблюдения объектов – метод светлого поля в проходящем свете. Тонкие окрашенные сравнительно прозрачные биологические образцы являются типичными объектами исследования в режиме проходящего света. Схемы прямого и инвертированного микроскопов для наблюдения объектов в режиме проходящего света показаны на рисунках 2 и 9.

Для непрозрачных амплитудных объектов (например, поверхность целого листа растения, органы и ткани мелких животных при микрооперациях или физиологических исследованиях, сколы костей и т.п.) толстые биологические образцы, шлифы минералов, металлов, полимеров и т.п.) метод наблюдения в проходящем свете, очевидно, не подходит. Такие объекты исследуют в режиме отраженного света (так называемый метод светлого поля в отраженном свете), используя микроскопы, оборудованные специальным осветителем (рисунок 10). При этом образец освещается через объектив с помощью полупрозрачного зеркала, установленного в тубусе микроскопа между объективом и окуляром. Отраженный и рассеянный образцом свет собирается тем же объективом и проходит сквозь полупрозрачное зеркало к окулярам. В таком режиме объектив играет роль, как объектива, так и конденсора, а разрешение микроскопа и яркость изображения определяются формулами (7) и (10), как для самосветящихся объектов.

Рисунок 10. Принципиальная оптическая схема и общий вид прямого микроскопа для наблюдения препарата в отраженном свете.

1.3. Способы анализа фазовых объектов Помимо амплитудных объектов микроскоп может быть использован и для наблюдения, так называемых, фазовых объектов, которые меняют не амплитуду света, а его фазу. Фазовые объекты – это слабо контрастные препараты, детали которых плохо различимы в проходящем или отраженном свете, из-за низкого поглощения и рассеяния света этими препаратами. Если в составе слабо контрастного объекта присутствуют компоненты (структуры), которые отличаются от окружающего вещества по показателю преломления и имеют размер сравнимый или меньше длины волны света, то свет, проходя через такие компоненты, будет, не меняясь по интенсивности, изменять свою фазу (фазу световой волны). Глаз человека, фотопленка, ПЗС-матрица (в английской аббревиатуре ССD-матрица) цифровых фотоаппаратов и видеокамер не способны воспринимать изменений фазы света, в отличие от его интенсивности (амплитуды). Поэтому, чтобы наблюдать фазовые объекты в микроскоп, необходимо преобразовать изменение фазы световой волны в изменение ее амплитуды. Существуют несколько методов преобразования, которые усиливают контраст в изображениях фазовых объектов: метод темного поля

ОСНОВЫ ОПТИЧЕСКОЙ МИКРОСКОПИИ

в проходящем или отраженном свете, методы фазового и дифференциального интерференционного контраста. Эти методы реализуются с помощью специальных оптических устройств: специальных конденсоров, объективов и дополнительных оптических элементов, помещаемых на пути собранного объективом света.

Метод темного поля в проходящем свете. Свет от осветителя направляется на исследуемый объект специальным темнопольным конденсором.

Свет направляется на объект под очень большим углом к оптической оси объектива, формируя полый внутри световой конус (рисунок 11). Если на пути этого света нет никаких оптических неоднородностей, то он вообще не попадает в объектив, и вместо изображения в микроскопе наблюдается однородно темное поле. Если в составе исследуемого объекта есть элементы (структуры) размером сравнимые или меньше длины волны и отличающиеся по показателю преломления, то на них будет происходить дифракция света с изменением направления его распространения (рисунок 11). Часть лучей света после дифракции попадает в объектив и используется для построения изображения, описывающего распределение фазовых неоднородностей в исследуемом объекте (рисунок 12).

Рисунок 11. Принцип метод темного поля в проходящем свете. Темнопольный конденсор направляет свет под очень большим углом к оптической оси объектива, формируя полый внутри световой конус. Слева - в отсутствии препарата свет не попадает в объектив, а в окуляры видно однородное темное поле. Справа - свет дифрагирует на неоднородностях препарата. Часть лучей света после дифракции попадает в объектив и формирует изображение, описывающее распределение фазовых неоднородностей в исследуемом объекте.

Рисунок 12. Изображение клеток К562, полученное методом темного поля в проходящем свете. Метка соответствует 10 мкм.

Метод ультрамикроскопии. Предельным случаем метода темного поля можно считать метод ультрамикроскопии. Препараты (растворы, газы) в ультрамикроскопе освещаются перпендикулярно оптической оси объектива.



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 16 |