WWW.KNIGI.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 16 |

«Учебно-методическое обеспечение для подготовки магистров по программам высшего профессионального образования направления подготовки Нанотехнология с профилем подготовки ...»

-- [ Страница 2 ] --

Яркость изображения (В) объекта при наблюдении в микроскоп в режиме проходящего света зависит от числовой апертуры объектива A, числовой апертуры конденсора А’ и общего увеличения микроскопа, как Яркость изображения (В) препарата при наблюдении в микроскоп в режиме отраженного света зависит от числовой апертуры объектива A и общего увеличения микроскопа, как 1.2. Конструкционные особенности микроскопов.

Ключевым элементом микроскопа является объектив. Для самосветящихся объектов именно свойства объектива полностью определяют предельную разрешающую способность микроскопа (формула (6)) и яркость изображения (формула (10)). Для несамосветящихся объектов помимо объектива существенную роль играют свойства конденсора (формулы (8) и (9)). Важными характеристикам объективов являются: увеличение (формула (2)), числовая апертура (формула (5)) и рабочее расстояние.

Выбор увеличения объектива определяется размером области объекта, которую необходимо наблюдать. Чем меньше увеличение объектива, тем большую область образца можно наблюдать с его помощью и наоборот. Если диаметр области препарата, наблюдаемой с помощью 2-кратного (обозначают 2) объектива, составляет 10 мм, то при переходе на 20 объектив диаметр этой области уменьшится в 10 раз и составит 1 мм, а 100 объектив позволит наблюдать область препарата диметром лишь 100 мкм. Диапазон увеличений современных объективов варьирует от 1 до 250.

Ключевой задачей микроскопии является обеспечение наилучшего разрешения при наблюдении объекта в микроскоп. А как следует из формул (6) и (8), разрешающая способность определяется числовой апертурой объектива.

Чем больше числовая апертура объектива, тем выше разрешающая способОСНОВЫ ОПТИЧЕСКОЙ МИКРОСКОПИИ ность микроскопа. Поэтому, выбирая объектив по параметру «увеличение», необходимо учитывать, обеспечивает ли числовая апертура этого объектива требуемое разрешение. Например, у 10 объективов числовая апертура может варьировать от 0,2 до 0,5, а разрешение (на длине волны света 0,5 мкм) при этом меняется соответственно от 1,3 до 0,5 мкм. Повышение числовой апертуры объективов с небольшим увеличением является важным направлением развития современной оптики, поскольку такие объективы облегчают детальные исследования протяженных объектов (срезы тканей, многоклеточные организмы и т.п.), а также позволяют одновременно наблюдать за большим количеством мелких объектов (клеток животных, бактерий и т.п.).

Примерами таких объективов могут служить: 10 суховоздушный А=0,5;

20 маслоиммерсионный А=1,0; 40 маслоиммерсионный А=1,3. В этих разработках лидирует фирма Zeiss (Германия).

Если необходимо добиться наилучшего разрешения, то приходится использовать объективы с большим увеличением, так как именно у них наибольшая числовая апертура. Одним из современных рекордсменов по числовой апертуре является 100 маслоиммерсионный объектив фирмы Olympus (Япония), у которого А=1,65. Предельное разрешение такого объектива (на длине волны света 0,5 мкм) равно 0,16 мкм. Среди объективов с наибольшей числовой апертурой следует также отметить 60 маслоиммерсионный объектив с А=1,49 фирмы Nikon (Япония), 63 маслоиммерсионный объектив с А=1,47 фирмы Leica (Германия) и 63 маслоиммерсионный объектив с А=1,46 фирмы Zeiss (Германия). В современной исследовательской практике очень широко применяются 60 и 63 объективы с числовыми апертурами 1,2-1,4, а также 100 объективы с числовыми апертурами 1,3-1,4.

Рабочим расстоянием для объектива с воздушным зазором называют расстояние между фронтальной линзой объектива и поверхностью наблюдаемого объекта, когда фокус объектива настроен на самую ближнюю к объективу точку объекта. Рабочим расстоянием для иммерсионного объектива называют расстояние между фронтальной линзой объектива и поверхностью покровного стекла препарата, когда фокус объектива настроен на точку препарата сразу за покровным стеклом. Рабочее расстояние характеризует, на сколько глубоко можно «заглянуть» внутрь прозрачного объекта с помощью этого объектива, перестраивая фокус. Чем больше числовая апертура объектива, тем меньше его рабочее расстояние. Например, у 10 объектива по мере увеличения числовой апертуры в ряду 0,2, 0,25, 0,5 рабочее расстояние уменьшается соответственно 17,1, 4,4, 1,9 мм. Для объективов с большим увеличением и высокой числовой апертурой рабочие расстояния очень малы.

Например, у широко распространенных 60 и 100 объективов с числовыми апертурами 1,2-1,4 рабочее расстояние составляет всего 150-300 мкм. Для определенных задач существует специальная группа объективов с большим рабочим расстоянием. Такие объективы нужны, если требуется наблюдать за объектами через толстое дно планшетов, стенку флаконов, в изолированных от внешней среды камерах или если требуется проводить какие-то манипуляции с объектами под объективом. Естественно, что у таких объективов числовая апертура уменьшена. Например, специальный 40 объектив с А=0, может иметь рабочее расстояние 2,9-3,6 мм; 63 объектив с А=0,75 может иметь рабочее расстояние 1,7-2,3 мм.

Существенного увеличения числовой апертуры можно достичь только при использовании иммерсионной жидкости, помещаемой между препаратом и фронтальной линзой объектива (рис. 3, формула (5)). Поэтому объективы дополнительно подразделяются на суховоздушные и иммерсионные, а также по типу иммерсии на водоиммерсионные, маслоиммерсионные и с глицериновой иммерсией. Оптическая схема объектива специально рассчитывается под определенный показатель преломления иммерсионной среды. Поэтому нельзя (бесполезно) пытаться погружать суховоздушный объектив в иммерсионную жидкость, а также использовать не соответствующие маркировке объектива жидкости (масло вместо воды и т.п.). Разрешение и качество изображения от этого не улучшатся. Существуют специальные объективы универсальные по типу иммерсии. В их конструкции предусмотрено регулировочное кольцо для подстройки оптики объектива под заданный показатель преломления среды. Однако выбор таких объективов очень ограничен.



Наличие покровного стекла меняет геометрию прохождения света от объекта к объективу. Поэтому в оптической схеме современных объективов учитывается фактор покровного стекла и его толщины. В паспорте на объектив и на самом объективе обязательно указывается, рассчитан ли данный объектив на использование покровного стекла, и если да, то какой толщины должно быть это стекло. Стандартная толщина покровного стекла 0,17 мм.

Многие объективы изготовлены с учетом именно такой толщины стекла. В некоторых объективах предусмотрена коррекция на толщину стекла (например, от 0 до 0,17 мм, от 0,14 до 0,19 мм, от 0 до 2 мм), которая осуществляется поворотом специального регулировочного кольца с градуировкой.

Объективы с коррекцией от 0 до 2 мм удобно использовать для наблюдения биологических объектов через стенку флакона, дно чашки Петри или многолуночного планшета. Коррекция на толщину покровного стекла может быть предусмотрена как в иммерсионных, так и в суховоздушных объективах.

ОСНОВЫ ОПТИЧЕСКОЙ МИКРОСКОПИИ

Линзы, из которых построены объективы, даже если они идеально изготовлены, обладают рядом свойств, которые могут существенно ухудшать качество изображения и разрешающую способность микроскопа. К этим свойствам относятся наличие хроматических аберраций и кривизна поля изображения.

Фокусное расстояние линзы зависит от длины волны света (рисунок 5).

В результате этого изображение точечного объекта, светящегося белым светом, построенное с помощью линзы, будет размазано вдоль оптической оси линзы: линза не сможет сфокусировать лучи света разных длин волн в одну точку. Это свойство линзы носит название хроматической аберрации положения.

Рисунок 5. Хроматическая аберрация положения (слева) и ее коррекция на двух длинах волн (синий и красный лучи) Помимо положения фокуса линза также меняет размер изображения, получаемого с помощью света разных длин волн (рисунок 6). В результате этого изображение объекта, светящегося белым светом (стрелка), построенное с помощью линзы, окажется размазанным вдоль оптической оси и будет иметь размер, зависящий от длины волны света. Это свойство линзы носит название хроматической аберрации размера.

Рисунок 6. Хроматическая аберрация размера (слева) и ее коррекция на двух длинах волн (синий и красный лучи) с помощью Эти хроматические аберрации в значительной степени поддаются коррекции, которая достигается созданием специальных оптических систем из двух (дублет) или трех (триплет) склеенных линз (рисунки 5 и 6). Ахроматический дублет исправляет аберрацию на двух длинах волн (красная и синяя длины волн), а ахроматический триплет – на трех длинах волн (красная, зеленая и синяя длины волн). Объективы, в которых хроматические аберрации исправлены на двух длинах волн, имеют в своем названии приставку «ахромат»

и называются ахроматами. Объективы, в которых хроматические аберрации исправлены на трех длинах волн, имеют в своем названии приставку «апохромат» и называются апохроматами (рисунок 7). В некоторых наиболее сложных и дорогих объективах хроматические аберрации могут быть исправлены на 4 или более длинах волн. Об этом производитель информирует в паспорте на объектив. Специального названия для таких объективов не введено, и они также называются апохроматами.

Изображение плоского объекта, полученное с помощью линзы, не является плоским, а имеет некоторую кривизну. Как результат, в изображениях плоских протяженных объектов резкость деталей убывает от центра к краям поля зрения объектива. Благодаря аккомодации наши глаза частично исправляют этот недостаток, но системы регистрации изображений (фотоаппараты и видеокамеры) этой способностью не обладают. Оптические схемы современных объективов позволяют исправить кривизну поля изображения. Объективы, в которых такая коррекция предусмотрена, имеют в своих названиях

ОСНОВЫ ОПТИЧЕСКОЙ МИКРОСКОПИИ

приставку «план». Именно эти объективы следует использовать при проведении микроскопических исследований с применением систем регистрации изображений.

Таким образом, объективы категории планапохромат в наилучшей степени подходят для получения наиболее резких и контрастных изображений с помощью фотоаппарата или видеокамеры от многоцветных препаратов.

Рисунок 7. Устройство объективов, отличающихся по степени коррекции хроматических аберраций. Слева- объектив ахромат, состоящий из двух дублетов и фронтальной линзы. В центре – объектив полуапохромат, состоящий из трех дублетов, менисковой линзы и фронтальной линзы. Справа - объектив апохромат, состоящий из триплета, двух дублетов, менисковой линзы и полусферической фронтальной линзы.

Как будет рассмотрено ниже, существуют различные методы наблюдения объектов в микроскоп. Поэтому объективы дополнительно классифицируются по пригодности для определенных методов наблюдения: фазовоконтрастной микроскопии, поляризационных измерений, темнопольной микрокопии, конфокальной микроскопии, измерений в ультрафиолетовом (УФ) диапазоне, электрофизиологических исследований. Например, фазовоконтрастная микроскопия требует введения в оптическую схему объектива специального элемента – фазового кольца. Измерения в УФ диапазоне требуют высокого пропускания оптики на коротких длинах волн и соответственно накладывают на конструкцию объективов ограничения по количеству оптических элементов, их материалу и типу клея для склейки линз. Для конфоФеофанов А.В.

кальной микроскопии отбираются объективы с наименьшими хроматическими и сферическими аберрациями. Корпус объектива для электрофизиологических исследований изготавливается из инертного пластика.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 16 |