WWW.KNIGI.KONFLIB.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 
<< HOME
Научная библиотека
CONTACTS

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 16 |

«Учебно-методическое обеспечение для подготовки магистров по программам высшего профессионального образования направления подготовки Нанотехнология с профилем подготовки ...»

-- [ Страница 1 ] --

Учебно-методическое обеспечение для подготовки кадров

по программам высшего профессионального образования для тематического

направления ННС «Нанобиотехнологии»

_

Учебно-методическое обеспечение для подготовки магистров

по программам высшего профессионального образования

направления подготовки «Нанотехнология» с профилем

подготовки «Нанобиотехнологии»

А.В. Феофанов

УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС

ДЛЯ МАГИСТРОВ ПО ДИСЦИПЛИНЕ

ОСНОВЫ ОПТИЧЕСКОЙ

МИКРОСКОПИИ

УДК 621 ББК 28.05 Ф 42 Ф 42 Феофанов, А.В. Основы оптической микроскопии [текст]:

учебно-методический комплекс для бакалавров по дисциплине / А.В. Феофанов. – М., 2010. – 153 с.

ISBN Охраняется законом РФ об авторском и смежном правах. Воспроизведение всего учебно-методического комплекса или его любой части (в том числе в электронном виде) без письменного разрешения автора и издателя запрещается. Попытки нарушения закона будут преследоваться в судебном порядке.

ISBN © Феофанов А.В., © НОУ ДПО «Институт информационных технологий “АйТи”», ЧАСТЬ 1.

ТЕКСТЫ ЛЕКЦИЙ

Феофанов А.В.

ВВЕДЕНИЕ

Оптическая микроскопия уже более 300 лет является исследовательским инструментом, который все более разнообразно и широко используется в биологии, биофизике и медицине. Быстрое развитие современных биологических технологий, таких как генная, белковая, клеточная инженерия, многие элементы которых могут быть отнесены к биотехнологиям в нанометровом диапазоне (нанобиотехнологиям) ставит на повестку дня новые вопросы, связанные с углубленным изучении процессов синтеза, транспорта и взаимодействий биологических молекул в живой клетке, а также с практическим использованием этих знаний. Оптическая микроскопия незаменима в поиске ответов на многие из этих вопросов.

Цель данного курса лекций – познакомить слушателей с современными методами оптической микроскопии и их применениями, сформировать понимание, как эти методы могут способствовать развитию нанобиотехнологий, решению разнообразных задач генной, белковой и клеточной инженерии.

В начале курса рассматривается устройство, принципы формирования изображения, и разрешение оптического микроскопа. Дается характеристика основным модулям микроскопа, рассмотрены их разновидности с привязкой к функциональным характеристикам. Проводится сравнительный анализ методов наблюдения препаратов в проходящем и отраженном белом свете, темного поля, фазового и дифференциального интерференционного контраста; рассматривается их применение для анализа окрашенных, неокрашенных и слабоконтрастных биологических объектов.

Особый акцент в рамках курса делается на изучении устройства и принципов действия флуоресцентных микроскопов, позволяющих наблюдать флуоресценцию молекул в клетках и тканях. Рассматриваются основные типы молекулярных инструментов, флуоресцирующих молекул, которые являются основой уникальных методик флуоресцентной микроскопии.

В курсе описывается, как методы оптической микроскопии применяются к изучению структуры и функции клеток, клеточных структур, биологических клеточных процессов, а также клеточного транспорта, взаимодействий и активности эндогенных и экзогенных (природных, синтетических и биоинженерных) молекул.

ОСНОВЫ ОПТИЧЕСКОЙ МИКРОСКОПИИ

РАЗДЕЛ 1. СВЕТОВОЙ МИКРОСКОП И МЕТОДЫ НАБЛЮДЕНИЯ

ОБЪЕКТОВ ПОД МИКРОСКОПОМ

1.1. Оптический микроскоп: устройство и характеристики Световой или оптический микроскоп – это оптическое устройство, использующее свет для получения сильно увеличенных изображений мелких объектов, способное обеспечить анализ деталей этих объектов с разрешением от 0,15 мкм до нескольких мм.

Из истории развития световой микроскопии. Первые микроскопы появились в конце 16- начале 17 века. Имя изобретателя и дата изобретения микроскопа точно неизвестны. Существуют данные, что приблизительно в 1590 г оптическое устройство типа микроскопа было изобретено в семейной мастерской голландских мастеров очков Ханса Янссена и его сына Захария Янссена. Известно, что Галилео Галилей представил публике свою модель сложного микроскопа в 1609 г. Возможным изобретателем микроскопа считают также Корнелия Дреббеля, который демонстрировал работающий сложный микроскоп в 1619 г. Первоначально сложный микроскоп представлял собой двухлинзовую оптическую систему. В микроскопе Галилея использовались двояковыпуклая линза-объектив и двояковогнутая линза-окуляр. В микроскопе Дреббеля использовались двояковыпуклая линза- объектив и двояко- или плосковыпуклая линза-окуляр.

Термин «микроскоп» был предложен в 1625 г. членом Римской «Академии зорких» («Akudemia dei lincei») И. Фабером (от микро... и греч. skopo - смотрю). В качестве инструмента для научных исследований, в частности, в анатомической практике сложный микроскоп Галилея начали применять примерно с 1624-1625 г.

Наиболее ранними из известных применений оптической микроскопии в биологических исследованиях считаются работы Роберта Гука (R. Hooke 1635-1703). Им были получены первые микроскопические изображения растительных клеток и введен сам термин «клетка» (рисунок 1).

Рисунок 1. Cлева: изображение микроскопа Р. Гука.

Справа: первое опубликованное изображение растительных клеток, полученное Р. Гуком с помощью микроскопа. Ему же принадлежит и сам термин «клетка» (cell). Рисунки из работы Р. Гука «Микрография или некоторые физиологические описания мельчайших телец, сделанные с помощью увеличивающих стекол.



С наблюдениями и исследованиями в этой связи» (1665 г.).

Монография Р.Гука, посвященная микроскопическим исследованиям, стала отправной точкой в работах по микроскопии Антони ван Левенгука (A.

van Leenwenhoek, 1632 - 1723), который научился изготавливать 300-кратные высококачественные линзы и, используя микроскопию, первым зарисовал и описал сперматозоиды, эритроциты, инфузории, строение глаз насекомых, мышечные волокна. Левенгук считается открывателем микроорганизмов и пионером применения микроскопии в зоологии.

За прошедшие 400 лет, как оптическая схема, так и механическое устройство микроскопа претерпели значительные изменения и продолжают интенсивно совершенствоваться. К основным механическим элементам современного микроскопа относятся (рисунок 2) штатив с тубусодержателем, кронштейнами и креплениями, а также механизмы вертикального перемещения столика (или тубусодержателя) и конденсора. Оптическая часть представлена (рисунок 2) окулярами, объективами, и осветительной системой.

ОСНОВЫ ОПТИЧЕСКОЙ МИКРОСКОПИИ

Принципиальная оптическая схема микроскопа.

Увеличенное изображение объекта формируется в микроскопе следующим образом (рисунок 2). Объект, помещенный на предметный столик, освещается через конденсор светом галогеновой лампы. Часть света, прошедшего через объект собирается объективом. Объектив создает перевёрнутое увеличенное действительное изображение объекта. Это изображение рассматривают через окуляр. Окуляр расположен так, что изображение объекта, созданное объективом, находится между передним фокусом окуляра и окуляром (Foк).

В этих условиях окуляр работает как лупа, формируя мнимое увеличенное изображение объекта. Хрусталик глаза наблюдателя, выполняет функцию линзы, создавая на сетчатке глаза действительное изображение объекта.

Обычно мнимое увеличенное изображение объекта формируется микроскопом на расстоянии 250 мм от глаза. Это расстояние наилучшего видения, при котором глазу удобнее всего различать мельчайшие детали наблюдаемого объекта.

Общее увеличение микроскопа ( ) является произведением линейного увеличения объектива () на угловое увеличение окуляра (ок) Как правило, = 28 1500.

Линейное увеличение объектива определяется, как где - оптическая длина тубуса, f oб — фокусное расстояние объектива.

Как правило, = 4100.

Угловое увеличение окуляра определяется, как где foк — фокусное расстояние окуляра в мм. Как правило, ок= 715.

Из-за ограничения по разрешающей способности бессмысленно делать микроскоп со слишком большим увеличением. Полезное увеличение микроскопа где А- числовая апертура объектива.

Числовая апертура определяется, как где n — показатель преломления среды между фронтальной линзой объектива и объектом (покровным стеклом препарата), — половина угла раствора светового пучка, попадающего в объектив из точки объекта, находящейся на оптической оси объектива (Рисунок 3). У воздуха n=1,0, и числовая апертура объективов с воздушным зазором согласно формуле (5) не может превышать 1,0. На практике числовая апертура объективов с воздушным зазором (сухо-воздушных объективов) не превышает 0,95.

Чтобы увеличить числовую апертуру, между объективом и объектом помещают иммерсионную жидкость с показателем преломления больше 1,0.

Как видно из рисунка 3, иммерсионная жидкость уменьшает преломление на границе раздела фаз и улучшает эффективность сбора света объективом при анализе биологических препаратов, заключенных между предметным и покровным стеклами. Наиболее часто в качестве иммерсионных жидкостей используют минеральное масло (n=1,515), глицерин (n=1,470) и воду

ОСНОВЫ ОПТИЧЕСКОЙ МИКРОСКОПИИ

(n=1,333). Использование иммерсионных жидкостей позволяет увеличить числовую апертуру объектива и разрешение микроскопа.

Рисунок 4. А. Изображение светящейся точки формируется в виде дифракционной картины, центральный максимум которой называют диском Эри. На графике показано распределение интенсивности света в дифракционной картине.

Б. Две светящиеся точки, находящихся на расстоянии, распознаются на сетчатке глаза, как разрешенные (т.е. как два отдельных объекта), если интенсивность света в центре между ними хотя бы на 4% меньше, чем в максимумах соответствующих дисков Эри.

Задача микроскопа состоит в том, чтобы дать возможность различить наиболее мелкие детали наблюдаемого в микроскоп объекта. Это свойство микроскопа называется разрешающей способностью или разрешением. Предельное разрешение микроскопа (пр) для самосветящихся объектов где - длина волны света, d – диаметр диска Эри.

Что такое диск Эри? Изображение светящейся точки формируется даже идеальной оптической системой в виде дифракционной картины (рисунок 4), центральное пятно (центральный максимум) которой называют диском Эри.

Диаметр диска Эри:

Для несамосветящихся объектов:

где A' — числовая апертура конденсора.

При A = 1,3 и = 0,5 мкм предельное разрешение светового микроскопа составляет пр = 0,2 мкм. В плоскости объекта (оси X, Y) оптический микроскоп обеспечивает субмикронное разрешение. Вдоль оптической оси микроскопа (ось Z) разрешение зависит от свойств объектива и для биологических препаратов, заключенных между предметным и покровным стеклами, не превышает нескольких микрон. Улучшенное разрешение обеспечивают 4Pi), конфокальная и двухфотонная виды микроскопии.

Чем больше увеличение микроскопа, тем меньшая область объекта наблюдается через этот микроскоп и тем меньшее количество света доходит от объекта до глаза наблюдателя. Иными словами, когда увеличение микроскопа возрастает, яркость изображения объекта снижается. Компенсировать снижение яркости можно увеличением числовой апертуры конденсора и/или объектива.



Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 16 |